液相色譜儀(HPLC)是分析實(shí)驗室常用的測試儀器之一，其應用越來(lái)越廣泛。此種儀器在使用過(guò)程中，難免會(huì )出現各種各樣的問(wèn)題，并將直接影響到所測數據的準確性和儀器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚預防和排除這些故障的方法，就可正確地使用儀器并zui大限度地發(fā)揮儀器的性能。今天我們要從以下幾個(gè)方面和您分享下在使用液相色譜儀中需注意的幾個(gè)問(wèn)題。一、使用試管的問(wèn)題1、試管的潔凈問(wèn)題。液相色譜分析法是一個(gè)很靈敏的分析方法，如果因使用不潔凈的試管，便會(huì )影響試驗結果的準確性。例如，在用甲醇作溶劑來(lái)溶解樣品時(shí)，所用的小試管是用橡膠塞來(lái)做蓋子的，因此，在每次進(jìn)樣時(shí)，都有一個(gè)保留時(shí)間固定的干擾峰存在，后經(jīng)證實(shí)，此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產(chǎn)生，換用玻璃試管后，干擾峰消除。2、塑料試管的溶解問(wèn)題。近年來(lái)，一次性塑料試管給試驗人員帶來(lái)了極大的方便，但是，在使用過(guò)程中一定要注意有機溶劑對試管的溶解現象，在利用此種試管提取樣品時(shí)，有些有機溶劑對管壁有溶解現象，這些被溶解下來(lái)的物質(zhì)有時(shí)也能在檢測器上產(chǎn)生信號，從而干擾樣品的測定。這時(shí)，可用相同的實(shí)驗條件先行試驗一下，看看不含被抽提物時(shí)，提取液在檢測器上能否產(chǎn)生干擾信號，如確有干擾信號存在，就只能換用耐有機溶劑的玻璃試管了。3、被測樣品在試管壁上的吸附問(wèn)題。這個(gè)問(wèn)題也應引起注意，否則也會(huì )影響測試結果的準確性，在治療藥物監測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被測藥物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，為防止提取中吸附現象的發(fā)生，可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑，可有效地防止吸附。二、操作進(jìn)樣閥的問(wèn)題目前，在分析型液相色譜儀中常用的進(jìn)樣閥是7725型進(jìn)樣閥，其內部的六通閥結構使進(jìn)樣操作非常方便，但是，如果使用不當，也會(huì )帶來(lái)問(wèn)題。例如，在液相色譜法的試驗過(guò)程中，有時(shí)會(huì )有異常色譜峰的出現以及重現性不好的問(wèn)題，這主要是由于操作方法不當所引起，要想解決此類(lèi)問(wèn)題，需從以下幾個(gè)方面入手。1、進(jìn)樣量的控制。用進(jìn)樣閥來(lái)進(jìn)樣時(shí)，閥內的樣品環(huán)是定量的，(一般分析型進(jìn)樣閥的樣品環(huán)體積為20ul)，由于進(jìn)樣時(shí)，注射到進(jìn)樣閥內的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此，要想使樣品環(huán)中充滿(mǎn)樣品溶液，從而使用進(jìn)樣閥來(lái)準確地定量，則必須使進(jìn)樣量大于樣品環(huán)體積的2倍。如果用注射器來(lái)控制進(jìn)樣量，則zui大只能注射樣品環(huán)體積1/2的量，這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導致定量分析的誤差。2、進(jìn)樣閥的清潔問(wèn)題。如果樣品環(huán)中有上次進(jìn)樣時(shí)樣品的殘留，必然會(huì )污染下次注射進(jìn)的樣品，為防止這種現象的發(fā)生，應按下列步驟操作：a.進(jìn)樣閥有2個(gè)位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時(shí)，以注射器將流動(dòng)相注入進(jìn)樣閥內清洗幾次，每次用量大約40ul；b.然后將進(jìn)樣閥板手扳至INJECT位置時(shí)，再以流動(dòng)相清洗幾次，每次用量還是40ul；c.zui后，再將樣品注射到進(jìn)樣閥里。按照上述的步驟操作，可以避免由進(jìn)樣閥引起的污染，從而使干擾峰消除并提高分析結果的準確性。3、進(jìn)樣閥溢流管的堵塞。有時(shí)，進(jìn)樣閥的溢流管會(huì )發(fā)生堵塞現象，向進(jìn)樣閥內注射樣品時(shí)，注射針推不動(dòng)。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動(dòng)相用的是鹽溶液，而其中的鹽在溢流管的排空端口處結晶所致。此時(shí)，可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡，端口處鹽的結晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次進(jìn)樣完成之后，用蒸餾水反復沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發(fā)生。三、流動(dòng)相(MOBLLE PHASE)的問(wèn)題甲醇和乙腈在液相色譜分析法中常常被用來(lái)配制流動(dòng)相。液相色譜法中常用的試劑是高等級的試劑，如色譜純試劑。在要求不太嚴格時(shí)，優(yōu)級純甚至分析純的試劑也能用。液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器，因此，從降低基線(xiàn)噪音和提高分析靈敏度上來(lái)考慮，應該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純試劑。1、流動(dòng)相的過(guò)濾。配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來(lái)過(guò)濾。這是因為溶液中含有很多肉眼難以發(fā)現的微小顆粒，如果不把它們?yōu)V除掉，就會(huì )堵塞泵口、柱頭上的過(guò)濾器，這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時(shí)，要換用經(jīng)過(guò)濾的流動(dòng)相，并將堵塞的濾器拆下來(lái)浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物。2、流動(dòng)相的脫氣。流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體，否則，這些氣體會(huì )使柱填料的性能降低，還能夠對檢測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮氣脫氣等。真空脫氣法和氮氣流脫氣法是目前zui常用的脫氣法。水和甲醇混合后會(huì )產(chǎn)生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會(huì )進(jìn)入色譜柱和檢測器，并將影響分析工作的正常進(jìn)行。 四、色譜柱的使用和保養 色譜柱是液相色譜儀zui主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著(zhù)決定性的作用。因此，在日常工作中，應特別注意色譜柱的正確使用和維修保養，以延長(cháng)色譜柱的使用壽命。1、使用預柱和保護柱。預柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間，它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了*的平衡，并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱。保護柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱，保護柱應與色譜柱的填料相同。預柱和保護柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長(cháng)了色譜柱的使用壽命。2、防止氣體進(jìn)入色譜柱。有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的，否則將會(huì )使柱效降低甚至形成微小的難以驅除的氣室。因此，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱，一定要使用經(jīng)過(guò)脫氣的流動(dòng)相，并且要嚴格按照下列步驟來(lái)安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀(guān)察是否有溶劑滲出；b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進(jìn)入；c.如無(wú)溶劑滲出時(shí)，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了，此時(shí)，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上，以流動(dòng)相來(lái)反方向沖洗色譜柱，以便將柱內的空氣排除。以0.2ml/min的小流量來(lái)沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì )導致柱性能的降低；d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說(shuō)明柱內的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了。3、色譜柱的清洗。為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來(lái)洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時(shí)應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內的極性小的物質(zhì)洗脫下來(lái)，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動(dòng)相是緩沖溶液，則應先用蒸餾水來(lái)沖洗色譜柱，以沖掉柱內的鹽，然后再用合適的溶劑來(lái)沖洗。凝膠濾過(guò)色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相，用完之后當然要用蒸餾水來(lái)沖洗。如果是連續操作，可以將緩沖溶液置于柱內，但是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動(dòng)相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。4、色譜柱的存放。如果色譜柱暫時(shí)不用，存放時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：a.幾天之內的短期放置，應先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來(lái)沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。b.如果色譜柱長(cháng)期不用，僅用上述方法來(lái)處理就不行了，這時(shí)應使用色譜柱使用說(shuō)明書(shū)中所指明的溶劑來(lái)充滿(mǎn)色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內如果有微生物的生長(cháng)則會(huì )使柱效降低，此時(shí)應用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來(lái)沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長(cháng)期放置時(shí)，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現象，因這可導致柱效的嚴重降低。c.色譜柱應貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內就會(huì )結冰，這也將導致柱效的降低。五、色譜峰的雙峰問(wèn)題長(cháng)期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進(jìn)入，就會(huì )使色譜柱入口處的固定相“板結"并在流動(dòng)相所產(chǎn)生的高壓作用下，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時(shí)可按下述方法來(lái)修復色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時(shí)就會(huì )發(fā)現柱頭內的固定相已被壓縮進(jìn)去了，嚴重時(shí)可縮進(jìn)10mm以上。在這種情況下，我們可用針尖將流動(dòng)相表層板結變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區填平、壓實(shí)，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復工作即告結束。用經(jīng)過(guò)修復后的色譜柱再做樣品時(shí)，色譜峰就恢復正常了。