分光光度計的原理和用途分光光度計特點(diǎn)　　1、采用高性能光柵，波長(cháng)精度更高；　　2、采用進(jìn)口鎢燈，發(fā)光效率高，使用壽命長(cháng)，功耗降低；　　3、超大規模集成，T/A轉換精度高，穩定性高；　　4、微機系統的應用，使操作使用簡(jiǎn)單可靠。 分光光度計描述　　分光光度法則是通過(guò)測定被測物質(zhì)在特定波長(cháng)處或一定波長(cháng)范圍內光的吸收度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。常用的波長(cháng)范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(2)400～760nm的可見(jiàn)光區,(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見(jiàn)光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進(jìn)行校正檢定。 分光光度計工作原理　　分光光度計采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(cháng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(cháng)的光源，光源透過(guò)測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比?！　紊廨椛浯┻^(guò)被測物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(cháng)度）成正比，其關(guān)系如下式：　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc　　式中 :A 為吸光度；　　I。為入射的單色光強度；　　I 為透射的單色光強度；　　T 為物質(zhì)的透射率；　　k 為摩爾吸收系數；　　L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(cháng)　　c 為物質(zhì)的濃度　　物質(zhì)對光的選擇性吸收波長(cháng)，以及相應的吸收系數是該物質(zhì)的物理常數。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測定,故又稱(chēng)比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時(shí)應用標準品或對照品同時(shí)操作。 分光光度計用途　　核酸的定量　　核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(cháng)260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者zui頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大?！　∈聦?shí)上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的準確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì )導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著(zhù)樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計的測試范圍）。zui后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項?！　〕撕怂釢舛?，分光光度計同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0?！　〉鞍踪|(zhì)的直接定量（UV法）　　這種方法是在280nm波長(cháng)，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開(kāi)”。與測試核酸類(lèi)似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現讀數“漂移”。這是一個(gè)正常的現象。事實(shí)上，只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì )被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高?！　”壬ǖ鞍踪|(zhì)定量　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數目直接相關(guān)，從而反應蛋白質(zhì)濃度?！　”壬椒ā　∫话阌蠦CA，Bradford，Lowry 等幾種方法?！　owry 法：以zui早期的Biuret 反應為基礎，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時(shí)間較長(cháng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法?！　CA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(cháng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系*，反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾?！　radford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時(shí)，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標準品會(huì )導致同一樣品的結果差異較大，無(wú)可比性?！　∧承┏醮谓佑|比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著(zhù)。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構成，尋找化學(xué)構成類(lèi)似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時(shí)間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時(shí)間內測試。時(shí)間過(guò)長(cháng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會(huì )讓石英或者玻璃著(zhù)色，導致樣品吸光值不準確?！　〖毦毎芏龋∣D 600）　　實(shí)驗室確定細菌生長(cháng)密度和生長(cháng)期，多根據經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長(cháng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長(cháng)的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細胞計數，做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗中偶爾會(huì )出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養基，即細菌培養一段時(shí)間后，與培養基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態(tài)?！　》止夤舛扔嫷闹匾浼?mdash;— 比色杯　　比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著(zhù)色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內測試樣品?！　∮捎诹硗鉁y試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠(chǎng)家提供不同容積的比色杯以滿(mǎn)足用戶(hù)不同的需求。目前市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量?jì)H需50μl，比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新。隨著(zhù)生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展，對此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學(xué)實(shí)驗室*的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗室的*設備之一?！　‰S著(zhù)科技的發(fā)展，現在比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計時(shí)的*物品。目前國外Nanodrop公司（現已被Thermo Fisher公司收購）生產(chǎn)的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經(jīng)可以做到無(wú)需稀釋樣品，無(wú)需使用比色杯，每次測量?jì)H需1-2μl樣品即可完成測量。 分光光度計注意事項　　1．該儀器應放在干燥的房間內，使用時(shí)放置在堅固平穩的工作臺上，室內照明不宜太強。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng)，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩定?！　?．使用本儀器前，使用者應該首先了解本儀器的結構和工作原理，以及各個(gè)操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應該對儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線(xiàn)應牢固，通電也要良好，各個(gè)調節旋鈕的起始位置應該正確，然后再按通電源開(kāi)關(guān)?！　?．在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必須于“0”刻線(xiàn)上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調節。 分光光度計使用方法　　1.接通電源，打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān)，掀開(kāi)樣品室暗箱蓋，預熱10分鐘?！　?.將靈敏度開(kāi)關(guān)調至“1”檔（若零點(diǎn)調節器調不到“0”時(shí)，需選用較。）　　3.根據所需波長(cháng)轉動(dòng)波長(cháng)選擇鈕?！　?.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內，使空白管對準光路?！　?.在暗箱蓋開(kāi)啟狀態(tài)下調節零點(diǎn)調節器，使讀數盤(pán)指針指向t=0處?！　?.蓋上暗箱蓋，調節“100”調節器，使空白管的t=100，指針?lè )€定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄?！　?.比色完畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。