抗體的選擇和保存指南
當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時(shí)候,如何選擇適合我們實(shí)驗需要的
抗體,并恰當保存使用,是每個(gè)科研人員需要細心考慮的??贵w種類(lèi)繁多,品牌眾
多,技術(shù)參數不一,價(jià)格和質(zhì)量更是相差甚大,如何購買(mǎi)到高質(zhì)量?jì)r(jià)格合適的抗體
,并準確地做出我們想要的結果,其中有很多細節需要注意。
一、怎樣選擇適合你實(shí)驗需要的抗體
1、一抗選擇要點(diǎn)
(1)確定抗體的名字,注意中英文名字、它名、亞型等信息。
(2)確定你的實(shí)驗類(lèi)型,Elisa,WB,IHC,ICC,還是FACS。一般抗體的說(shuō)明書(shū)都
會(huì )列出該抗體經(jīng)驗證過(guò)適用于何種實(shí)驗的類(lèi)型,如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應用類(lèi)
型,并不意味著(zhù)該抗體不適用于此種分析應用類(lèi)型,而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種實(shí)驗
驗證,請根據說(shuō)明書(shū)列出的已驗證的類(lèi)型來(lái)選擇適合你實(shí)驗的抗體。
(3)確定實(shí)驗樣本的種屬,Human,Mouse,還是Rat。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗
體經(jīng)試驗驗證過(guò)適用于何種物種實(shí)驗,請根據說(shuō)明書(shū)列出已驗證的種屬來(lái)選擇適合
你實(shí)驗的抗體。
(4)樣本蛋白的結構性質(zhì)。了解樣本蛋白的結構性質(zhì)有助于選擇zui合適的抗體,
待測樣本蛋白的結構域和樣本在提取和處理過(guò)程中是否會(huì )變性,蛋白空間構象的改
變,會(huì )影響抗體的免疫親和反應。
(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主,一般單克隆抗
體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍
弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現非特異性染色(可以通過(guò)封閉等避免
)。
2、二抗選擇要點(diǎn) :
(1)種屬來(lái)源。主要根據一抗種屬來(lái)源來(lái)決定購買(mǎi)二抗來(lái)源,如一抗是小鼠來(lái)源
,那二抗就買(mǎi)抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇
Biotin標記的二抗,以與后面的SP結合反應,而免疫熒光染色就需要購買(mǎi)不同熒光
素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。
二、抗體的穩定性
1. 抗體的穩定性是自然界長(cháng)期進(jìn)化的結果??贵w是免疫系統中zui重要的分子之一
,其穩定性是自然進(jìn)化篩選的結果。在眾多物種中,抗體分子形成了保守而穩定的
結構。
2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下,甚至短時(shí)間溫度達到50-60℃,抗體分子都能
維持正確折疊,保持應有的活性。
3. 抗體的純度。采用先進(jìn)的抗體純化技術(shù),確??贵w產(chǎn)品的高純度,保障其抗體
產(chǎn)品的穩定性。
4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失,高濃度
的抗體穩定性更好,抗體產(chǎn)品中93%的濃度大于0.5mg/ml。
三、怎樣確定抗體購買(mǎi)渠道和品牌
國外抗體品牌的質(zhì)量一般沒(méi)問(wèn)題,但價(jià)格較貴,而且很多抗體品牌本身不
生產(chǎn)抗體,隨著(zhù)網(wǎng)絡(luò )技術(shù)的越來(lái)越普及,我們自己就可以通過(guò)國內外的相關(guān)來(lái)
檢索,國外zui大的生物試劑查詢(xún):biocompare,大的生物試劑查詢(xún)
:丁香通,來(lái)查找我們所需要的產(chǎn)品資料。
四、怎樣保存已獲得的抗體
抗體無(wú)論是保存還是運輸都應盡可能地避免反復凍融,收到抗體后請根據實(shí)驗
的需要,對抗體進(jìn)行分裝,避免同一管抗體反復凍融(反復凍融會(huì )導致抗體空間結
構變性,導致多聚體形成,從而降低抗體的結合能力)??贵w保存得當與否,直接
決定了抗體的活性和使用效果,如果抗體保存得當,抗體活性大部分都可以維持數
年。請謹記,無(wú)論何時(shí)請按照說(shuō)明書(shū)推薦的保存條件正確處理和保存抗體。
1. 收到抗體后,請務(wù)必在4℃,12000rpm,離心3分鐘,(無(wú)論是液體還是凍干粉
狀態(tài)),再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul,請延長(cháng)離心時(shí)間至
5分鐘,以保證全部抗體均離心下來(lái))??贵w一般使用特制的儲存管,只有在
12000rpm離心3分鐘,才能將附著(zhù)在管壁或蓋內的抗體全部離心下來(lái)(即使是在
10000rpm離心也會(huì )離心不*,導致出現抗體的量不足的現象)。
2.(1)對絕大多數抗體來(lái)說(shuō),保存在-20℃就*足夠了,沒(méi)有任何證據顯示保
存在-80℃會(huì )更好。
(2)分裝可以zui大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害,同時(shí)也降低了由于多
次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(3)分裝的量以一次實(shí)驗用完為好,zui少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小
,抗體的濃度越可能會(huì )受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。
(4)復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來(lái)。
(5)抗體工作液應該當天配制當天用完,4℃保存盡量不要超過(guò)1天。
(6)避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中,將抗體保存在冰箱里層,避免溫度
變化造成反復凍融。
3.大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒(méi)有影響。
4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過(guò)程需要1~2周的時(shí)間,所以是在低溫4℃
的條件下來(lái)完成的。 4℃運輸zui主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害
(如果使用干冰運輸,那么收到時(shí)抗體是凍起來(lái)的,為了分裝就需要解凍,這就多
了一次凍融的過(guò)程),所以運輸過(guò)程中避免干冰運輸。 關(guān)于*
(sodium azide)的使用: 為了防止微生物污染,*經(jīng)常被加入到抗體中
(終濃度0.02% (w/v))。
注:*的去除方式 可以通過(guò)凝膠電泳或過(guò)濾的方式去除,IgG的分子量
是150kDa(IgM約600kDa);*的分子量只有65Da,使用截留分子量為14kDa
的濾膜即可將*從抗體中去除。v 抗體的選擇和保存指南
當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時(shí)候,如何選擇適合我們實(shí)驗需要的
抗體,并恰當保存使用,是每個(gè)科研人員需要細心考慮的??贵w種類(lèi)繁多,品牌眾
多,技術(shù)參數不一,價(jià)格和質(zhì)量更是相差甚大,如何購買(mǎi)到高質(zhì)量?jì)r(jià)格合適的抗體
,并準確地做出我們想要的結果,其中有很多細節需要注意。
一、怎樣選擇適合你實(shí)驗需要的抗體
1、一抗選擇要點(diǎn)
(1)確定抗體的名字,注意中英文名字、它名、亞型等信息。
(2)確定你的實(shí)驗類(lèi)型,Elisa,WB,IHC,ICC,還是FACS。一般抗體的說(shuō)明書(shū)都
會(huì )列出該抗體經(jīng)驗證過(guò)適用于何種實(shí)驗的類(lèi)型,如果抗體說(shuō)明書(shū)沒(méi)有提及的應用類(lèi)
型,并不意味著(zhù)該抗體不適用于此種分析應用類(lèi)型,而僅是說(shuō)明尚未經(jīng)過(guò)此種實(shí)驗
驗證,請根據說(shuō)明書(shū)列出的已驗證的類(lèi)型來(lái)選擇適合你實(shí)驗的抗體。
(3)確定實(shí)驗樣本的種屬,Human,Mouse,還是Rat。一般抗體說(shuō)明書(shū)都列出該抗
體經(jīng)試驗驗證過(guò)適用于何種物種實(shí)驗,請根據說(shuō)明書(shū)列出已驗證的種屬來(lái)選擇適合
你實(shí)驗的抗體。
(4)樣本蛋白的結構性質(zhì)。了解樣本蛋白的結構性質(zhì)有助于選擇zui合適的抗體,
待測樣本蛋白的結構域和樣本在提取和處理過(guò)程中是否會(huì )變性,蛋白空間構象的改
變,會(huì )影響抗體的免疫親和反應。
(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主,一般單克隆抗
體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍
弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現非特異性染色(可以通過(guò)封閉等避免
)。
2、二抗選擇要點(diǎn) :
(1)種屬來(lái)源。主要根據一抗種屬來(lái)源來(lái)決定購買(mǎi)二抗來(lái)源,如一抗是小鼠來(lái)源
,那二抗就買(mǎi)抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇
Biotin標記的二抗,以與后面的SP結合反應,而免疫熒光染色就需要購買(mǎi)不同熒光
素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。
二、抗體的穩定性
1. 抗體的穩定性是自然界長(cháng)期進(jìn)化的結果??贵w是免疫系統中zui重要的分子之一
,其穩定性是自然進(jìn)化篩選的結果。在眾多物種中,抗體分子形成了保守而穩定的
結構。
2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下,甚至短時(shí)間溫度達到50-60℃,抗體分子都能
維持正確折疊,保持應有的活性。
3. 抗體的純度。采用先進(jìn)的抗體純化技術(shù),確??贵w產(chǎn)品的高純度,保障其抗體
產(chǎn)品的穩定性。
4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失,高濃度
的抗體穩定性更好,抗體產(chǎn)品中93%的濃度大于0.5mg/ml。
三、怎樣確定抗體購買(mǎi)渠道和品牌
國外抗體品牌的質(zhì)量一般沒(méi)問(wèn)題,但價(jià)格較貴,而且很多抗體品牌本身不
生產(chǎn)抗體,隨著(zhù)網(wǎng)絡(luò )技術(shù)的越來(lái)越普及,我們自己就可以通過(guò)國內外的相關(guān)來(lái)
檢索,國外zui大的生物試劑查詢(xún):biocompare,大的生物試劑查詢(xún)
:丁香通,來(lái)查找我們所需要的產(chǎn)品資料。
四、怎樣保存已獲得的抗體
抗體無(wú)論是保存還是運輸都應盡可能地避免反復凍融,收到抗體后請根據實(shí)驗
的需要,對抗體進(jìn)行分裝,避免同一管抗體反復凍融(反復凍融會(huì )導致抗體空間結
構變性,導致多聚體形成,從而降低抗體的結合能力)??贵w保存得當與否,直接
決定了抗體的活性和使用效果,如果抗體保存得當,抗體活性大部分都可以維持數
年。請謹記,無(wú)論何時(shí)請按照說(shuō)明書(shū)推薦的保存條件正確處理和保存抗體。
1. 收到抗體后,請務(wù)必在4℃,12000rpm,離心3分鐘,(無(wú)論是液體還是凍干粉
狀態(tài)),再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul,請延長(cháng)離心時(shí)間至
5分鐘,以保證全部抗體均離心下來(lái))??贵w一般使用特制的儲存管,只有在
12000rpm離心3分鐘,才能將附著(zhù)在管壁或蓋內的抗體全部離心下來(lái)(即使是在
10000rpm離心也會(huì )離心不*,導致出現抗體的量不足的現象)。
2.(1)對絕大多數抗體來(lái)說(shuō),保存在-20℃就*足夠了,沒(méi)有任何證據顯示保
存在-80℃會(huì )更好。
(2)分裝可以zui大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害,同時(shí)也降低了由于多
次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(3)分裝的量以一次實(shí)驗用完為好,zui少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小
,抗體的濃度越可能會(huì )受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。
(4)復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來(lái)。
(5)抗體工作液應該當天配制當天用完,4℃保存盡量不要超過(guò)1天。
(6)避免將抗體保存在自動(dòng)除霜冰箱中,將抗體保存在冰箱里層,避免溫度
變化造成反復凍融。
3.大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒(méi)有影響。
4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過(guò)程需要1~2周的時(shí)間,所以是在低溫4℃
的條件下來(lái)完成的。 4℃運輸zui主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害
(如果使用干冰運輸,那么收到時(shí)抗體是凍起來(lái)的,為了分裝就需要解凍,這就多
了一次凍融的過(guò)程),所以運輸過(guò)程中避免干冰運輸。 關(guān)于*
(sodium azide)的使用: 為了防止微生物污染,*經(jīng)常被加入到抗體中
(終濃度0.02% (w/v))。
注:*的去除方式 可以通過(guò)凝膠電泳或過(guò)濾的方式去除,IgG的分子量
是150kDa(IgM約600kDa);*的分子量只有65Da,使用截留分子量為14kDa
的濾膜即可將*從抗體中去除。
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